A varfarina exerce a sua ação anticoagulante atuando como antagonista da vitamina K, enquanto cofator enzimático na carboxilação dos resíduos de ácido glutâmico das proteínas que compõem os fatores de coagulação II, VII, IX, X e proteínas anticoagulantes endógenas C, S e Z.

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Sumariamente, a vitamina K tem de ser reduzida para poder atuar como cofator da gama-glutamil carboxilase. Durante o processo metabólico, a gama-glutamil carboxilase oxida a vitamina K a um epóxido. Como a varfarina apresenta semelhanças estruturais com a vitamina K, o efeito anticoagulante acontece pela interferência deste xenobiótico na ação da vitamina K epóxido redutase que regeneraria a forma oxidada da vitamina K ao seu estado reduzido e dessa forma permitiria a sua reutilização pela gama-glutamil carboxilase. Ao interromper este ciclo, é impedida a carboxilação necessária à ativação das proteínas da cascata de coagulação.​